01 你听说过类**吗？
我们在国外生化类科幻**中经常看到人造人，在制作改造人之前他们会做一些人造**，所有我们经常会看到一些心脏或者其他**在培养液中的画面，当然这些都是人们的脑洞所想象出的科幻电影。但是我们目前的科研水平已经实现了3D类**的构建。2009年，荷兰Hubrecht研究所的 Hans Clevers 团队成功的将成体干细胞培养成为小肠的隐窝和绒毛结构，开启了类**发展的新篇章。下面小爱继续给您介绍什么是类**？

Hans Clevers-小肠干细胞marker Lgr5发现者

02 什么是类**？
类**顾名思义就是一种类似**但又不是**的3D细胞团结构。通过在体外培养胚胎或成体干细胞，让其增殖分化形成具有一定形态结构及功能的类似于**的3D细胞团结构。这些细胞结构虽然不是真正意义上的人类**，但能在某些结构和功能上模拟真实**，因此，把这些微型人造**命名为：类**（organoids）。

类**明场图及组化鉴定

03 类**的发展史
类**的研究热点主要是病人来源的类** (Patient-Derived Organoids, PDOs)，因为通常用于肿瘤患者的疾病建模、研究与药物筛选，常常被称为肿瘤类**。肿瘤类**的发展开始于2013年，自此之后呈逐年上升趋势。肿瘤类**是指将患者活检、穿刺或手术切除组织在基质胶中培养数周得到的类**。肿瘤类**在高度保持源肿瘤的异质性和患者之间的异质性的同时，类**个体间形态、尺度保持基本均一，为肿瘤发病机理研究、药物筛选、个性化精准医疗、再生医学等领域提供了快速、优良的技术平台。

类**的发展成果，主要集中在近十余年。
• 2007年，Hans Clevers 的实验室通过 lineage tracing 验发现小肠和结肠的干细胞为 Lgr5+细胞。
• 2009年，Hans Clevers实验室使用单个鼠LGR5+肠干细胞在体外自组织成为具有肠隐窝-绒毛结构的肠类**。
• 2011年，由人多能干细胞和原代成体干细胞发育而来的肠类**被成功制作。同年，由鼠胚胎干细胞培育而来的视网膜类**被首次成功培育。
• 2012年，由人多能干细胞发育而来的视网膜类**成功培育。
• 2013年，由人多能干细胞发育而来的脑类**被成功培育。肝、肾、胰类**被成功培育。
• 2014年，前列腺、肺类**被成功培育。
• 2015年，乳腺、输卵管、海马体类**被成功培育。
• 2020年，蛇毒液腺类**被成功培育。

04 类**的分类
目前类**分为两类：组织来源类**和多能干细胞来源类**。下面是已经构建成功的类**种类

05为什么要“类**”
相比传统的二维培养模型，类**代表着一种能够概括整个生物体生理过程的创新技术，具有更接近生理细胞组成和行为、更稳定的基因组、更适合于生物转染和高通量筛选等优势。而与动物模型相比，类**模型的*作更简单，还能用于研究疾病发生和发展等机理。因而在**发育、精准医疗、再生医学、药物筛选、基因编辑、疾病建模等领域都有广泛的应用前景。

类** VS 组织样本 VS 动物模型

06 类**相关研究实验流程
类**的培养可以利用体细胞、成体干细胞（包括祖细胞）或多能干细胞。类**培养**主要包括基质胶、维持类**生态所需因子和分化所需因子这几个主要元素。基质胶中含有胶原、巢蛋白和纤连蛋白等等，为类**形成三维空间结构提供基质。维持类**生态因子主要目的为促进细胞的增殖和抑制细胞凋亡等。

下面以小肠组织为例
实验材料
1、 仪器设备
CO2 培养箱、双人单面超净台、倒置显微镜、台式冷冻离心机、水浴锅、水浴摇床，医用冰箱、-80°冰箱、移液器（一套）、眼科剪、眼科镊。

2、 试剂耗材
肠癌类**培养试剂盒(abs9445)，基质胶(abs9495)，60mm细胞培养皿，100μm滤筛，15ml离心管，1.5ml EP管若干，4度冰盒，眼科剪刀，眼科镊，

试剂盒组成

实验方法
1、原代
（1）将组织放入含有特殊组织保存液F的组织取样瓶中放入冰盒4℃，拍照并登记信息。
（2）取样瓶消毒，组织放入培养皿，结直肠癌类**缓冲液A清洗三次后于培养皿中剪碎，大约1mm3的组织块。
（3）癌组织用organo原代酶解液C消化，37℃震荡消化10-20 min，（消化过程中随时观察消化情况）加入三倍体积organo原代酶终止液E终止消化。
（4）使用100μm孔径的筛网进行过滤，取少量滤液在镜下进行观察，可以看到明显的组织块，将滤液收集后于300g富集离心3-5min后移去上清，重新重悬离心。
（5）去除上清，使用适量基质胶（abs9495）进行重悬(24孔板为例，每孔30ul）之后进行铺板（4℃下*作）拍照****。
（6）将铺好的板子放入37℃培养箱中10-15min成胶，添加培养基B（恢复室温）进行培养。

2、类**传代培养
（1）移液器吸去培养基，添加4℃类**缓冲液A放置一分钟。
（2）移液枪轻柔吹打基质胶，收集在15ml离心管中，4℃静置5min。（3）离心5min弃去液体，添加适量类**缓冲液A重悬移入1.5ml离心管，300g离心5min弃去液体或（添加适量消化液D作用90-120S终止，离心5min弃去混合液）。
（4）类**收集后，添加适量类**冻存液G，按500个/ml密度冻存（或进行步骤5）。
（5）类**收集后，基质胶重悬，每孔30μl基质胶铺在24孔板中，放置培养箱中10min添加500μl结直肠癌类**培养基B。

3、冻存
（1）在传代第二步，添加冻存液
（2）500个/ml 密度冻存，温度梯度降温-80度，保存

4、类**复苏
（1）取10ml于15ml离心管中。
（2）从液氮罐中取出冻存的肿瘤类**细胞，快速置于 37℃水浴锅中融解。
（3）水浴融解过程中，需轻轻摇动冷冻管，以确保冻存液在 1-2 分钟内完全融解。
（4）将溶解后的类**细胞快速转移至15ml 无菌离心管，使用移液管轻轻吹打3次，300g 离心 3分钟，然后除去上清液并收集类**细胞沉淀。添加适量结直肠癌类**缓冲液A重悬移入1.5ml离心管300g离心5min。
（5）基质胶重悬，每孔20μl基质胶铺在24控板中，放置培养箱中10min添加500μl结直肠癌类**培养基B。

5、鉴定
类**的鉴定主要有形态学观察、基因分析、标志物检测、组织学染色这几种手段。

6、药敏
（1）药物准备阶段（药物种类、浓度）。
（2）在传代基础上接种到96孔板上，加药，牌照。在药物活性第5天检测细胞活性。

类**药敏检测全流程

07 类**研究相关技术及解决方案
1 基因编辑技术在类**研究中的应用
CR**PR-Cas9是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御，可用来对抗入侵的**及外源DNA。CR**PR-Cas9基因编辑技术，则是对靶向基因进行特定DNA修饰的技术，这项技术也是用于基因编辑中前沿的方法。

2020年3月2日，荷兰胡布勒支研究组在Nature Cell Biology**上发表文章Fast and efficient generation of knock-in human organoids using homology-independent CR**PR–Cas9 precision genome editing，利用非同源依赖的CR**R-Cas9技术快速高效地对人源类**进行基因敲入，作者们将该技术命名为CR**PR–HOT(CR**PR-Cas9-mediated homology-independent organoid transgenesis)，为人源类**的内源基因敲入提供了重要的工具平台。

文章通过使用CR**PR-HOT的遗传工具来研究肝细胞如何**和具有太多DNA的异常肝细胞如何出现。通过让癌基因TP53失去功能，他们发现异常肝细胞的非结构化**更为频繁，这可能有助于促进癌症产生。随后使用CR**PR-HOT将荧光标记**人类类**的DNA中，从而使得这些荧光标记附着在他们想要研究的特定基因上，建立了人肝脏导管类**的报告基因品系，可以利用**成像、切片染色等方式可视化观察内源表达的基因表达模式以及动态变化过程。

2 类**在研究疾病发生发展的机制中应用-基因编辑
研究背景：在印戒癌(SRCC)中常见E-钙粘蛋白的表达缺失，CDH1基因编码E-钙粘蛋白，是钙依赖性细胞粘附蛋白，属于钙粘蛋白家族成员，CDH1基因参与调节细胞粘附、迁移和上皮细胞增殖，其功能缺失导致细胞更容易侵袭与转移，该基因的突变与胃癌密切相关。因此，E-钙粘蛋白表达的缺失可能会增加患胃癌的概率。

2022年6月，日本科研团队在Gastric Cancer上发表了Potential therapeutic targets discovery by transcriptome ****ysis of an in vitro human gastric signet ring carcinoma model，利用基本编辑技术，敲出了正常胃癌类**的CDH1基本，，构建了E-钙粘蛋白的胃癌类**模型。

通过RNA-seq测序，研究发现敲除后的肿瘤类**与SRCC的细胞形态和细胞活力类似，同时还发现，CDH 1 KO hGO细胞中matrix metalloproteinase (MMP）基因上调，MMP为水解细胞外基质蛋白质的酶类，包括基质中以及整合于质膜中的各种胶原酶和弹性蛋白酶等。然后科学家们对95例临床胃癌组织样本进行免疫荧光验证，结果显示，MMP-3 的确在临床样本中高表达。此外发现，CXCR4从细胞核易位细胞膜上，加入CXCR4的配体CXCL12后，基因敲除的类**生长期变长，在临床SRCC患者中纤维细胞分泌高表达CXCL12。从而得出结论MMP和CXCL12/CXCR4有望成为E -cadherin**性SRCC的新治疗靶点。

3 单细胞测序中类**技术应用
单细胞测序技术也是近年来受到青睐的明星技术，分别在2018年和2019年被 Science 期刊评为年度十大技术，被 Nature methods 评为年度方法。高通量单细胞测序技术通过对每个细胞遗传物质的分析，在单细胞分辨率下研究细胞的发育、分化，成为探索组织发育、肿瘤异质性等生物问题的重要方法。单细胞转录组测序与类**结合，pubmed关键词搜索已经达到251篇，类**技术极大推动了**发育、肿瘤研究、药物筛选、临床研究等多个领域的发展。

2021年11月，德国科学家团队在 nature communication上发表了Single-cell ****ysis of patient-derived PDAC organoids reveals cell state heterogeneityand a conserved，文章构建了18个原发性胰腺导管腺癌和6个胰腺导管腺癌肝转移肿瘤类**，通过10X genomic单细胞转录组测序比较分析肿瘤类**和原发性 PDAC，鉴定共有细胞亚群，包括循环祖细胞和分化的分泌细胞亚群。“classical”细胞亚群为胰腺导管腺癌分化发育的最终形态。在基于**成像的药物筛选实验中，发现“classical”亚群细胞基因表达，则对药物反应敏感。

PDAC离体肿瘤样本很难获取，且恶性细胞含量较低。通过建立 PDAC单细胞转录图谱，显示与原组织相似，证明了 PDAC 类**可作为肿瘤异质性体外研究的临床相关模型，可为患者临床治疗预后判断提供依据。

08类**的未来发展
1 类**未来发展方向-血管生成
目前大多类**本身并不具备血管化的结构。随着类**体积的增长，类**受限于氧气的缺失以及代谢废物的增加，可能导致的组织坏死。已有研究构建血管内皮细胞微环境的肿瘤类**，将类**肿瘤细胞和血管内皮细胞在Matrigel上共同培养，生成血管结构以期解决类**血管化缺失的问题

2 类**未来发展方向-共培养
2019年Nature Protocol 期刊发表了肿瘤类**和免疫细胞共同培养的相关protocol，可以体现和模拟出肿瘤微环境的部分特征。以上皮类**和免疫细胞共培养模型为例，可通过在培养基中添加活化的免疫细胞、在组织消化成单细胞后和免疫细胞共同生长、添加ECM中的重组细胞因子等方法重塑类**和免疫细胞的相互作用。

3 类**未来发展方向-标准化
标准的形成，是在我国干细胞标准委员会及陈晔光院士的支持和推动下，由陈晔光院士团队***内几十家单位制定。编者联合学术界、产业界专家对肠癌类**的培养，鉴定和质控等一系列过程进行了探讨，经过大量数据研究及充分研讨，最终形成国内首个人肠癌类**标准，为类**技术的临床研究和临床实践提供了规范和指导。

该标准规定了人肠癌类**及人肠道类**的定义、伦理要求、技术要求和检测方法，为患者来源的人肠癌类**的制备和检测提供了技术支持。该标准的制定获得了类**及标准领域中外专家广泛的关注与高度评价。

001299美能能源估值分析及打新申购建议

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